Wetenswaardigheden over de PCR-test en zijn toepassingen

Door Willem Engel

De Covidtest bestaat niet. COVID-19 is de naam voor een bekend ziektebeeld dat nu vermeend wordt veroorzaakt door een Betacoronavirus genaamd SARS-CoV-2 (voormalig Wuhan-CoV).¹

Er zitten nog meer haken en ogen aan. Hoe test je voor een ziekte? Het stellen van een diagnose is vooralsnog voorbehouden aan de arts. Deze heeft methoden en instrumenten ter beschikking om vast te stellen wat er aan scheelt en welke behandeling daar het beste bij past.²

Als we kijken naar ziekteverwekkers, ook wel pathogenen genoemd, dan is het belangrijk om te onderscheiden tussen opportunisten, vliegers en overlevers. We hebben nu te maken met een vlieger. Het aantonen van een vlieger in het slijmvlies is geen bewijs van infectie.³

Ook is het in dit geval zeer de vraag of het virus wel de hoofdoorzaak is van ernstige ziekte. We zien veel gevallen op de IC die eigenlijk aan een schimmelinfectie lijden. Dit geeft al aan dat ziekte vooral complex is en multifactorieel. De focus op één van de factoren zal dus geen volledige oplossing of preventie geven.

Een arts doet een differentiaal diagnose naar aanleiding van een vermoeden dat normaal door symptomen wordt ingegeven. Drie stappen zijn essentieel hierin : 1) aantonen, 2) verifiëren, 3) uitsluiten. Wat doet de PCR-test? In de huidige vorm toont die alleen aan of er een stukje genetisch materiaal aanwezig is dat overeenkomt met een standaard sequentie van het vermeende virus.⁴

Een goed ontworpen PCR-test bevat minimaal drie primers (targets) waarbij de eerste aantoont, de tweede bevestigt, en de derde uitsluit. In de huidige opzet wordt er vaak maar één target gekozen.⁵

Het idee is, als de test specifiek genoeg is, dat men de mogelijkheid uitsluit dat het stukje genetisch materiaal van iets anders kan zijn. Dat is natuurlijk geen echte uitsluiting zoals bedoeld bij falsificatie, waarbij juist getest moet worden op andere mogelijkheden. Vreemd is dan ook om te zien dat een differentiaaldiagnose wel wordt gedaan bij de Nivel peilstations, waarin acht mogelijke ziekteverwekkers worden getest.⁶

Het verhaal wordt nog gekker als je bedenkt dat bij IVMD (in vitro medical diagnostic device) naast een analytische ook een klinische validatie en verificatie moet worden gedaan. Deze ontbreekt in zijn geheel. Er is alleen een analytische validatie en verificatie gedaan. Dat houdt in dat er geen CE-markering is voor de huidige test. In de CE-markering worden vooral de ‘intended use’ en de kaders voor het gebruik vastgesteld.

Zelfs al zouden de juiste test allemaal zijn gedaan, dan nog is er een probleem. Voor een klinische diagnose zijn er symptomen nodig. Anders is er namelijk geen vermoeden te bevestigen. Hier zit het grote verschil. Bij bv. het serologisch onderzoek wordt gekeken naar welk percentage van de bevolking een bepaald gen heeft of een bepaald eiwit. Dit zegt niets over of deze mensen ziek zijn. Het laat alleen een prevalentie zien.

Dan komen we bij de test zelf. Wat we daarbij moeten opmerken is dat er vele verschillende merken beschikbaar zijn die net iets anders in elkaar zitten. Idealiter bevat een test targets van verschillende genen van het pathogeen. Bv. een sequentie van de envelope, een sequentie van de spike en of een sequentie van het nucleocapside. Wat ook vaak wordt gedaan, is een zeer conservatief stuk pakken van het pathogeen dat in alle versies, varianten en stammen voorkomt. Bij de betacoronavirussen wordt dit ook wel een pan-Sarbecotest genoemd.

Om er zeker van te zijn dat de sequentie niet een vals-positief bevat, wordt vaak gebruikt gemaakt van een ‘nested’ target. Dit houdt in dat er binnen de sequentie van een target een kleiner target wordt gekozen. Het tweede kan alleen een positief signaal geven als het eerste überhaupt is geselecteerd en geamplificeerd.

Tot de MERS (Middle East Respiratory Syndroom) PCR-testen in 2014 zien we deze opzet gebruikt worden. Soms wel vijf of zes targets om er zeker van te zijn dat een positieve test ook echt de aanwezigheid van het pathogeen betreft. Daarna is er een vreemde ontwikkeling. Steeds meer targets worden weggelaten. Ook de plekken van het genoom en de nested opzet worden losgelaten. De huidige vorm is daarmee dus zeer foutgevoelig.

Zeker als je je realiseert dat met de RT-qPCR er eigenlijk geen echte PCR test meer wordt gebruikt maar een afgeleide daarvan. De q staat voor quantitative, dat wordt bereikt door naast de forward primer en reverse primer ook een probe te gebruiken. Het idee is, dat als de beide primers een amplicon opleveren (sequentie die wordt geamplificeerd), de probe wordt losgeknipt en daardoor het fluorescerende gedeelte geactiveerd wordt. Dus hoe meer probe er na binding wordt losgeknipt, des te meer signaal. Dit geeft idd een kwantificering. Maar of dit ook werkt in klinische samples moet wel worden vastgesteld. Dat is niet gedaan.

Daarnaast wordt de kwantificering gebruikt als een mate van besmettelijkheid. Dit is op geen enkele manier te rechtvaardigen. De Ct-waarde (cycle threshold) kan hooguit worden gebruikt voor het vaststellen per assay (protocol samen met lab en apparatuur) wat de cut-off waarde is (van analoog naar digitaal). Deze is meestal rond de 27 cycli. Dat roept de vraag op waarom er dan standaard toch tot 45 cycles wordt doorgemeten.

De gouden standaard is het zeker niet. Dat is het virus zelf d.m.v. viruskweek. De verwarring ontstaat omdat voor de snelheid en schaalbaarheid de PCR breed inzetbaar is. Voor het genetisch onderzoek wordt PCR ook gebruikt, maar ook daar is het niet de gouden standaard. Er worden economische relevantie en filosofische begrippen door elkaar gehaald.

Opsommend welke problemen de huidige test samen met het testbeleid heeft:

Asymptomaten testen maakt de uitslag betekenisloos.
Het gebrek aan CE-markering IVD maakt het klinische irrelevant.
Gebrek aan differentiaal diagnose maakt het onmogelijk om de oorzaak van de klachten te bepalen.
Aantonen van een sequentie is geen aantonen van ziekte of besmettelijkheid.
De test is niet robuust genoeg om de gevoeligheid en specificiteit te waarborgen die wordt geclaimd.
De test voldoet in opzet niet aan aantonen, bevestigen, uitsluiten.
Zowel de opzet als het gebruik zijn oorzaken van de voornamelijk vals positieven uitslagen.
Een inschatting van de foutmarge is niet mogelijk omdat de prevalentie niet wordt bepaald met een onafhankelijke separate test.